Anticorpos anti - Nucleolares

A Esclerodermia é uma doença do tecido conjuntivo que se caracteriza por fibrose da pele, com possível envolvimento de órgãos internos, tais como o pulmão, coração e rim, por lesão dos vasos sanguíneos e das células produtoras de colagéneo que os envolvem.

Predomina no sexo feminino, afectando cerca de 4 mulheres por cada homem.

Esta doença crónica divide-se em duas entidades clínicas diferentes: 

• localizada, em que a doença se limita a uma determinada área da pele;
• sistémica, com envolvimento da pele e de órgãos internos. Esta, por sua vez, ainda é dividida em duas formas clínicas distintas (limitada e difusa), que diferem quanto à extensão de envolvimento dos órgãos, evolução e prognóstico da doença.

A forma limitada da Esclerose sistémica envolve a pele da face e da parte distal dos membros, associando-se normalmente ao fenómeno de Raynaud e à ocorrência de hipertensão pulmonar (15% dos doentes). A forma difusa ocorre com envolvimento da pele do tronco e da zona proximal dos membros, bem como do coração e dos rins; o envolvimento pulmonar é mais precoce, com evolução para fibrose pulmonar.


Anticorpos anti - nucleolares  aparecem associados com esta patologia e podem detectar-se por imunofluorescência indirecta (I.F.I.) em células Hep2, devido à maior sensibilidade deste substrato. Podem observar-se padrões de fluorescência nucleolar homogéneo, granular fino e granular grosseiro.
O padrão homogéneo nucleolar deve-se à presença de anticorpos que reagem com o componente granular dos nucléolos Pm-Scl 4-6sRNA.
A presença de anticorpos anti-NOR-90 e anti-RNA polimerase traduz-se num padrão nucleolar granular fino.
Os anticorpos anti-fibrilharina, que reconhecem a U3-RNP do componente fibrilar, originam um padrão granular grosseiro (clumpy).
Os anticorpos anti - ribossomas associam-se a um padrão de fluorescência de localização citoplasmática e nucleolar.

Anticorpos anti - PM-Scl

Os anticorpos anti - PM- Scl ocorrem em, aproximadamente 17% dos doentes em que é identificado o padrão nucleolar, por I.F.I.. Ligam-se a um complexo macromolecular de 11-16 proteínas, com peso molecular variando entre 20 a 110 kD, localizado na parte granular do nucléolo, no nucleoplasma e no citoplasma. Utilizando a técnica de "imunoblot", verificou-se que os autoanticorpos se ligam às proteínas de 110kD e 75kD.
Ocorrem em aproximadamente 5 a 8% dos doentes com Polimiosite, 2 a 3% dos doentes com Esclerodermia e 24 a 50% dos doentes com síndrome de sobreposição Polimiosite-Esclerodermia. Este último grupo de doentes apresenta a forma limitada cutânea da Esclerodermia.
Os anticorpos anti - PM-Scl associam-se com maior frequência a miosite e nefropatia, durante a evolução da doença.
Sugere-se que estes autoanticorpos são um marcador prognóstico do desenvolvimento de artrite  e de    fenómeno de Raynaud. Estão ainda associados com alterações da motilidade esofágica e com discretas manifestações pulmonares intersticiais.

Anticorpos anti - NOR

Os anticorpos anti - NOR-90 ocorrem em, aproximadamente 5% dos doentes em que é identificado o padrão nucleolar, por I.F.I.. Ligam-se a proteínas nucleolares de 94  a 97 kD da região organizadora dos nucléolos (NOR). As zonas NOR são consideradas as zonas de união para a nucleologénese, em que os corpos pré-nucleolares convergem e se unem, para formar nucléolos em interfase. Nelas, encontram-se proteínas não histonas, como a RNA polimerase I, ADN Topoisomerase e fibrilharina.
A proteína NOR-90 localiza-se exclusivamente nas regiões organizadoras dos nucléolos das células em divisão, e nos nucléolos, durante a interfase.

Anticorpos anti - ARN polimerase

Constituem aproximadamente 15% dos anticorpos anti-nucleolares. As ARN - polimerases formam um complexo multiproteico de 8 a 14 polipeptídeos envolvidos na transcrição de diferentes genes. Cada enzima contém 2 subunidades de grandes dimensões (126 e 192 kD) e, pelo menos, seis de pequena dimensão (14 - 18 kD), sendo três delas comuns. O complexo principal contém 4 fosfoproteínas de 18, 64, 80 e 180 kD.
Existem três tipos de ARN polimerases designados por I, II e III, estando a de tipo I localizada no nucléolo e, as de tipo II e III localizadas no nucleoplasma.
Os anticorpos anti - polimerase I são identificados em aproximadamente 4-11% dos doentes com o diagnóstico de Esclerodermia cutânea grave e difusa. Estão associados à ocorrência de manifestações renais, cardíacas e hepáticas graves.
Os anticorpos anti - polimerase II estão habitualmente associados aos anti - ARN polimerase I e surgem em doentes com lúpus e síndromes de sobreposição.
Os anticorpos anti - polimerase III ocorrem em aproximadamente 12 - 23% dos doentes com esclerodermia, associando-se com os anticorpos anti - polimerase tipo I e II.

Anticorpos anti - fibrilharina (U3RNP)

Detectados em aproximadamente 48% dos soros de doentes com anticorpos anti - nucleolares. Ligam-se à fibrilharina, proteína integrante do componente fibrilar do nucléolo que se encontra associada à U3RNA, formando o U3RNP nucleolar.
Os anticorpos anti - fibrilharina são marcadores de diagnóstico da esclerodermia e marcadores de prognóstico em pacientes com envolvimento do intestino delgado, do músculo esquelético e com hipertensão pulmonar.

Anticorpos anti - To/Th - RNP

Estes anticorpos reconhecem uma enzima processadora do ARN, a MRP - ribonuclease (MRP ARN), responsável pela ruptura de endoribonucleótidos no ARN mitocondrial, considerando-se que participa na transcrição e replicação do ADN mitocondrial.
Identificam-se em aproximadamente 25% dos doentes com lúpus. Nos doentes com esclerodermia, estão associados a uma maior frequência de hipertensão pulmonar, fibrose pulmonar e lesão renal, sendo, por isso, um marcador de pior prognóstico que os anticorpos anti - centrómero.

    Relação entre a presença de determinados auto-anticorpos e o prognóstico da esclerodermia.

    Hep 2 (x400) - Anticorpos anti-nucleolares (anti-NOR90 - identificação por immunoblot). É
    característico a fluorescência nas regiões NOR das células em mitose (1) e a fluorescência de aspecto  
    granular fino nos nucléolos (2)
 

    Hep 2 (x630) - Anticorpos anti-nucleolares (anti-NOR90 - identificação por immunoblot). É
    característico a fluorescência nas regiões NOR das células em mitose (1) e a fluorescência de aspecto
    granular fino nos nucléolos (2)
 

    Hep 2 (x1000) - Anticorpos anti-nucleolares (anti-NOR90 - identificação por immunoblot). Nesta
    imagem, evidencia-se uma região NOR na célula em mitose (1) e o aspecto granular fino  da fluorescência
    nucleolar (2)

    Hep 2 (x400) - Anticorpos anti-nucleolares (anti-RNA Pol - identificação por immunoblot). Observa-se
    o aspecto granular  da fluorescência nucleolar (setas)

    Hep 2 (x630) - Anticorpos anti-nucleolares (anti-RNA Pol - identificação por immunoblot). Observa-se
    o aspecto granular  da fluorescência nucleolar (setas)

    Hep 2 (x1000) - Anticorpos anti-nucleolares (anti-RNA Pol - identificação por immunoblot). Nesta
    imagem, é bem visível o aspecto granular da fluorescência nucleolar. No citoplasma, observa-se uma
    fluorescência granular média dispersa (anticorpos anti - mitocondriais)

    Hep 2 (x400) - Anticorpos anti-nucleolares (anti - Th/To - identificação por immunoblot) - aspecto
    homogéneo da  fluorescência nucleolar (setas).

    Hep 2 (x630) - Anticorpos anti-nucleolares (Th/To - identificação por immunoblot).

    Hep 2 (x1000) - Anticorpos anti-nucleolares (Th/To - identificação por immunoblot).

    Hep 2 (x630) - Anticorpos anti-nucleolares (PMScl - identificação por immunoblot). Além do aspecto
    homogéneo e pleomórfico da fluorescência nucleolar, é característico o padrão granular fino denso do
    núcleo.

    Hep 2 (x630) - Anticorpos anti-nucleolares (PMScl - identificação por immunoblot).

Anticorpos anti - Scl70

A Esclerodermia é uma doença do tecido conjuntivo que se caracteriza por fibrose da pele, com possível envolvimento de órgãos internos, tais como o pulmão, coração e rim, por lesão dos vasos sanguíneos e das células produtoras de colagéneo que os envolvem.

Predomina no sexo feminino, afectando cerca de 4 mulheres por cada homem.

Esta doença crónica divide-se em duas entidades clínicas diferentes: 

• localizada, em que a doença se limita a uma determinada área da pele;
• sistémica, com envolvimento da pele e de órgãos internos. A Esclerodermia sistémica, por sua vez, ainda é dividida em duas formas clínicas distintas (limitada e difusa), que diferem quanto à extensão de envolvimento dos órgãos, evolução e prognóstico da doença.

A forma limitada da Esclerose sistémica envolve a pele da face e da parte distal dos membros, associando-se normalmente ao fenómeno de Raynaud e à ocorrência de hipertensão pulmonar (15% dos doentes). A forma difusa ocorre com envolvimento da pele do tronco e da zona proximal dos membros, bem como do coração e dos rins; o envolvimento pulmonar é mais precoce, com evolução para fibrose pulmonar.

A topoisomerase - I é um enzima localizado no nucleoplasma e nos nucléolos, unido à histona H1 e ao ADN. Cataliza a separação, o alongamento, a replicação e a transcrição do ADN, sendo também importante na organização da cromatina e na transcrição de genes de RNA ribossómico.


Os anticorpos anti - topoisomerase - I, inicialmente identificados em doentes com Esclerodermia, foram designados por anticorpos anti - Scl70, por reconhecerem uma proteína de 70 kDa. Posteriormente, foram identificados outros auto - anticorpos, dirigidos a uma proteína de 86 kDa (Scl-86).
Actualmente aceita-se a designação de anticorpos anti - topoisomerase - I para os anticorpos anti - Scl 70 e anti - Scl 86 que reconhecem a topoisomerase - I uma proteína básica de 100 kDa associada à histona H1 e ao ADN.


Por imunofluorescência indirecta (IFI) e por microscopia electrónica, é possível localizar o antigénio nas regiões nucleolares NOR visíveis durante a mitose, sendo a topoisomerase - I estável ao longo do ciclo celular.

Não existe uma relação direta entre a concentração de anticorpos anti - topoisomerase - I e as manifestações clínicas da Esclerodermia. Contudo, a concentração de anticorpos anti - topoisomerase - I correlaciona-se positivamente com o grau de envolvimento cutâneo e com a resistência vascular renal, e, negativamente, com a capacidade vital pulmonar.
Sugere-se a sua especificidade para a Esclerodermia (98%), embora a sensibilidade seja baixa e variável com a metodologia utilizada (20-40%).
Estes auto - anticorpos são mais frequentes nos doentes com Esclerodermia difusa (40-75%), relativamente àqueles que apresentam a forma limitada (5-20%).
Nos doentes com a forma difusa da patologia, a presença destes auto - anticorpos associa-se a um maior risco de fibrose pulmonar.
De um modo geral, os doentes com anticorpos anti - topoisomerase - I têm pior prognóstico e menor taxa de sobrevivência do que os doentes  com anticorpos anti - centrómero.
A associação de anticorpos anti - topoisomerase - I e de anticorpos anti - centrómero é excepcional.
A identificação de anticorpos anti - topoisomerase - I em doentes com síndrome de Raynaud primário, sugere o desenvolvimento posterior de Esclerodermia.
Noutras doenças autoimunes, a prevalência destes auto - anticorpos é baixa (geralmente inferior a 10%), sugerindo-se que a sua identificação nestas situações se deve a síndromes de sobreposição com a Esclerodermia.

Os anticorpos anti - topoisomerase - I são identificados por imunofluorescência indirecta (I.F.I.), utilizando como substrato células Hep - 2. O padrão de fluorescência no nucleoplasma varia de mosqueado fino a homogéneo, com ou sem fluorescência nucleolar ponteada, e cromatina positiva nas células em mitose, com ponteado característico.

   Hep2 (x630) - Anticorpos anti - topoisomerase - I. Observa-se fluorescência homogénea no núcleo (1), ponteada nos nucléolos (2) e  na cromatina das células em mitose ponteado característico (3)

   Hep2 (x630) - Anticorpos anti - topoisomerase - I. Observa-se fluorescência homogénea no núcleo (1), ponteada nos nucléolos (2) e na cromatina das células em mitose (3)

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - topoisomerase - I. Aspecto característico, destacando-se a fluorescência ponteada nos nucléolos

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - topoisomerase - I. Observa-se o aspecto característico da célula em mitose.

Anticorpos anti - Centrómero

A Esclerodermia é uma doença do tecido conjuntivo que se caracteriza por fibrose da pele, com possível envolvimento de órgãos internos (pulmão, coração e rim), por lesão dos vasos sanguíneos e das células produtoras de colagéneo que os envolvem.

Predomina no sexo feminino, afectando cerca de 4 mulheres por cada homem.

Esta doença crónica divide-se em duas entidades clínicas diferentes: 

• localizada - em que a doença se limita a uma determinada área da pele;
• sistémica - com envolvimento da pele e de órgãos internos. A Esclerodermia sistémica, por sua vez, ainda é dividida em duas formas clínicas distintas (limitada e difusa), que diferem quanto à extensão de envolvimento dos órgãos, evolução e prognóstico da doença.

A forma limitada da Esclerose sistémica envolve a pele da face e da parte distal dos membros, associando-se normalmente ao fenómeno de Raynaud e à ocorrência de hipertensão pulmonar (15% dos doentes). A forma difusa ocorre com envolvimento da pele do tronco e da zona proximal dos membros, bem como do coração e dos rins; o envolvimento pulmonar é mais precoce, com evolução para fibrose pulmonar.

Os anticorpos anti - centrómero são habitualmente identificados em doentes com a forma cutânea limitada da Esclerose Sistémica (80% dos doentes) e, mais raramente, na forma difusa (3-12%) desta patologia.
Aproximadamente 60 a 70% dos doentes com anticorpos anti - centrómero apresentam critérios de diagnóstico para a Esclerose Sistémica.
Os anticorpos anti - centrómero podem ser observados ocasionalmente noutras condições, nomeadamente na Artrite Reumatóide, no síndrome de Sjögren primário, no Lúpus Eritematoso Sistémico (2-5%), na Cirrose Biliar Primária, nas vasculites e na Hipertensão Pulmonar Primária. A sua identificação em doentes com Fenómeno de Raynaud, está associada com um aumento da probabilidade de futuro desenvolvimento de Esclerodermia Sistémica Limitada. Considera-se que os doentes com anticorpos anti - centrómero (e/ou Esclerose Sistémica Limitada) têm um risco acrescido de desenvolver hipertensão pulmonar, implicando uma maior vigilância.
Diversos estudos demonstram uma elevada especificidade dos anticorpos anti - centrómero para a Esclerose Sistémica (90% a 99.9%), sendo rara a sua identificação na ausência da patologia. No entanto, a sensibilidade é baixa (21.1% a 33%).
Não existe uma correlação entre o título de anticorpos anti - centrómero e o grau de actividade da doença, permanecendo os títulos estáveis ao longo do tempo.

Centrómero é o local de constrição primária dos cromossomas das células eucariotas durante a metáfase. A estrutura em forma de disco trilaminar na superfície do centrómero, designada por cinetocoro, é o local de ligação dos microtúbulos das células em divisão.
Embora os anticorpos anti - centrómero presentes nos soros de doentes com Esclerose Sistémica reconheçam diferentes polipeptídeos, existe uma associação fundamental com três proteínas centroméricas (CENP-A, de 19 kDa, CENP-B, de 80 kDa e CENP-C, de 140 kDa). Por vezes, podem ocorrer anticorpos dirigidos para outras proteínas centroméricas (CENP - D, E e F).




A detecção dos anticorpos anti - centrómero é efectuada por Imunofluorescência indirecta, utilizando como substrato as células Hep-2. O padrão de fluorescência é único e característico, com aspecto ponteado do núcleo e zona de condensação cromossómica positiva nas células em mitose.

    Hep2 (x400) - Anticorpos anti - centrómero.

  Hep2 (x630) - Anticorpos anti - centrómero. Além do ponteado nuclear, observa-se o aspecto característico da mitose (1).

     Hep2 (x1000) - Anticorpos anti - centrómero. Aspecto ponteado do núcleo.

    Hep2 (x1000) - Anticorpos anti - centrómero. Aspecto característico das células em mitose (1)

     Hep2 (x630) - Anticorpos anti - centrómero e anticorpos anti - mitocondriais.

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - centrómero e anticorpos anti - mitocondriais.

    Hep2 (x630) - Padrão misto (homogéneo, centrómero e fuso mitótico).
    1 - Padrão homogéneo (além do ponteado característico do padrão centrómero,observa-se um fundo      
          homogéneo
    2 - Padrão centrómero
    3 - Padrão fuso mitótico