International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies

International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies
Nancy Agmon-Levin, Jan Damoiseaux, Cees Kallenberg, et al.
Ann Rheum Dis published online October 14, 2013

Anticorpos anti - Ribossomas

Os ribossomas são organelos envolvidos na síntese proteica, estando presentes em todas as células. A sua classificação é feita de acordo com o seu coeficiente de sedimentação em gradiente de sacarose: os ribossomas (80S) são constituídos por duas subunuidades (60S e 40S). A subunidade de maior dimensão (60S) contém três fosfoproteínas ácidas, designadas por P0, P1 e P2, com pesos moleculares de 38kDa, 19kDa e 17kDa, respectivamente.

As imagens de microscopia electrónica demonstram que as duas subunidades se encaixam, proporcionando um entalhe por onde passa o ARNm quando o ribossoma se move durante o processo de tradução e por onde emerge a cadeia polipeptídica recém-formada.

                                             Adaptado de https://sites.google.com/site/kefalikinisi/home/fisiologia-                                                            humana-1/celula-e-celulas/ribossomas/

Os constituintes principais dos ribossomas são o ácido ribonucleico (ARN) e proteínas, em quantidades aproximadamente iguais. A carga eléctrica dos ribossomas é negativa, devido ao predomínio da carga dos fosfatos do ARN relativamente à carga positiva das proteínas, favorecendo a ligação a catiões e a corantes básicos.

O ARN ribossómico representa mais de 80% do total de ARN presente nas células.

Os anticorpos anti - ribossomas reagem com proteínas da subunidade 60S e da subunidade 40S do complexo ribossómico do citoplasma e, com alguma frequência, com os nucléolos. O antigénio é um complexo macromolecular de 140 kDa, constituído pelas proteínas P0, P1 e P2.

A maioria dos anticorpos anti - ribossomas P é da classe IgG, geralmente IgG1 e IgG3, ou IgG2. As proteínas P0, P1 e P2 possuem epítopos comuns constitúidos por uma sequência de 22 aminoácidos do fragmento carboxil terminal.

Os anticorpos dirigidos às proteínas do ribossoma P são considerados altamente específicos para o Lúpus Eritematoso Sistémico (LES) (10 - 35%). 

Ocorrem em cerca de 90% dos pacientes com lúpus e envolvimento do sistema nervoso central (SNC), com manifestações clínicas de psicose e depressão; a identificação e titulação destes auto-anticorpos é útil no diagnóstico diferencial destas situações, podendo ocorrer aumento de títulos até 5x, antes e durante as fases activas.      

Também podem ocorrer em doentes com LES e com manifestações orgânicas de envolvimento hepático ou renal.

Em doentes com LES, os anticorpos anti - ribossoma P associam-se com os anticorpos anti - Sm e anti - SSA, facto que parece relacionado com uma resposta imune a epítopos associados no ribossoma. Por exemplo, detectaram-se pequenas quantidades de antigénio Sm nos ribossomas e os anticorpos anti - Sm podem apresentar reacção cruzada com uma proteína ribossómica de 20kDa.          

Os anticorpos anti - ribossomas  originam um padrão de fluorescência denso fino granular (por vezes, homogéneo) no citoplasma das células Hep2 (IFI), com maior intensidade périnuclear. Também se pode observar fluorescência nucleolar homogénea (marcação das ribonucleoproteínas nucleolares).

Hep 2 - Anticorpos anti - ribossomas

Hep2 (x400) - Anticorpos anti - ribossomas. Observa-se fluorescência granular fina e densa no citoplasma

Hep2 (x630) - Anticorpos anti - ribossomas. Observa-se fluorescência granular fina e densa no citoplasma e fluorescência homogénea dos nucléolos (setas)

Hep2 (x630) - Anticorpos anti - ribossomas. Mantêm-se a fluorescência citoplasmática e nucleolar,           observando-se também alguns vacúolos (setas)

Hep2 (x630) - Anticorpos anti - ribossomas. 

Hep2 (x1000) - Anticorpos anti - ribossomas. Mantêm-se a fluorescência citoplasmática, observando-se também alguns vacúolos. Nesta imagem, não se observa a fluorescência nucleolar.

     

Anticorpos anti - aparelho mitótico

O aparelho mitótico é a estrutura celular responsável pelo movimento e organização dos cromossomas durante a divisão celular.
O fuso mitótico é uma estrutura dinâmica constituída por microtúbulos e um conjunto de proteínas que se organizam a partir dos centrossomas durante a profase.
Os microtúbulos são constituídos por tubulina e um conjunto de proteínas designado por PSAM (proteína S associada ao microtúbulo). Algumas destas proteínas actuam como autoantigénios.
O autoantigénio mais abundante do fuso mitótico é a proteína NuMA (centrofilina 240 kD). Outros autoantigénios menos frequentes são a SP-H, SP-N, MSA-3, CENP-F, MSA-35 (proteína de 35 kD, distribuída ao longo do fuso), MSA-36 (proteína de 36 kD, localizada na zona média do fuso), JB (proteína localizada na zona central do fuso e midbody), RMSA-1(proteína de 47 kD localizada no fuso mitótico) e a SPA-1 (pólos do fuso).
A proteína CENP-F é uma proteína da matriz nuclear que aparece unida ao cinetocoro na fase tardia G2, sendo rapidamente degradada durante a mitose. Na prometafase e na metafase, localiza-se na superfície mais externa do centrómero

Os anticorpos anti - aparelho mitótico originam padrões de imunofluorescência muito característicos, relacionados com as diferentes especificidades dos componentes a que se ligam os autoanticorpos.

Anticorpos anti - MSA1 - padrão de fluorescência mosqueado fino (nucleoplasma), identificando-se o centríolo e o fuso mitótico proximal.

    Hep2 (x400) - Anticorpos anti - MSA1

    Hep2 (x400) - Anticorpos anti - MSA1

    Hep2 (x400) - Anticorpos anti - MSA1

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA1

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA1

    Hep2 (x1000) - Anticorpos anti - MSA1

Anticorpos anti - MSA2 - padrão de fluorescência com grânulos grosseiros isolados (profase), fluorescência do cromossoma (metafase), corpos intermédios ou "midbody" (anafase) ou "anéis de clivagem" (telofase)

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA2

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA2

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA2

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA2

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA2

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA2

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA2

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA2

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA2


Anticorpos anti - MSA3 (CENP-F) - padrão mosqueado fino do núcleo, com intensidade variável de célula para célula e fluorescência intensa dos centrómeros (prometafase e metafase). A fluorescência pode não existir (células G1), ser de fraca intensidade (células S e G2) ou muito intensa (G2 tardia).
Na anafase precoce, identifica-se o "midbody".

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA3

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA3

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA3

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA3

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - MSA3

Anticorpos anti - tubulina - padrão de fluorescência do fuso, com fibras (metafase), e citoplasma com filamentos.

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - tubulina. 

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - tubulina

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - tubulina

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - tubulina

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - tubulina

Anticorpos anti - citoplasma do neutrófilo

Vasculites - grupo heterogéneo de doenças que, variando quanto à etiologia, características patológicas, quadro clínico, prevalência e prognóstico, partilham a existência de uma inflamação da parede dos vasos.

As vasculites autoimunes caracterizam-se pela ocorrência de anticorpos anti - citoplasma do neutrófilo na maioria dos doentes. Estes autoanticorpos ligam-se a enzimas localizados nos grânulos citoplasmáticos do neutrófilo (proteinase 3, mieloperoxidase, elastase e catepsina G).

O neutrófilo apresenta um núcleo com pequenos lobos (2 - 5), unidos por pontes finas de material nuclear. No citoplasma do neutrófilo, existem grânulos pequenos, com baixa afinidade para os corantes (neutrófilos), que se subdividem em grânulos primários (azurófilos), secundários (específicos) e terciários.

Neutrófilo - microscopia electrónica (adaptado de medcell.med.yale.edu)

A proteinase 3 é uma glicoproteína localizada nos grânulos azurófilos, fracamente catiónica, com actividade enzimática sobre diversos substratos.

A mieloperoxidase é uma proteína fortemente catiónica, localizada também nos grânulos azurófilos.

A BPI (bactericidal permeability increasing protein) é uma proteína catiónica com actividade antimicrobiana, também assosciada aos grânulos azurófilos.

A lactoferrina é uma proteína de ligação do ferro, localizada nos grânulos específicos.

A catepsina G e a elastase são serina - proteases, também localizadas nos grânulos azurófilos.

Os anticorpos anti - proteinase 3 (PR3) ocorrem na granulomatose com poliangeíte (previamente designada de granulomatose de Wegener), enquanto os anticorpos anti - mieloperoxidase (MPO) ocorrem predominantemente na poliangeíte microscópica.

A pesquisa de anticorpos de anti - citoplasma do neutrófilo efectua-se por imunofluorescência indirecta (IFI), utilizando como substrato neutrófilos humanos fixados pelo etanol. Esta fixação causa a rotura dos grânulos azurófilos, com libertação do seu conteúdo para o citoplasma.

Como a mieloperoxidade   é fortemente catiónica, vai ligar-se à membrana nuclear (carga negativa), originando o aspecto périnuclear (pANCA) que se observa na IFI, quando existem anticorpos anti - mieloperoxidase.

A proteinase 3, fracamente catiónica, mantém uma localização citoplasmática (aspecto cANCA na IFI).

Outro padrão de fluorescência que se pode observar na IFI é o padrão xANCA, mais fino que o pANCA e frequentemente granular. Estes autoanticorpos ocorrem na colite ulcerosa (30-80% dos pacientes) e na doença de Crohn (2-40%). Embora a sua pesquisa não seja decisiva para o diagnóstico diferencial ou para a decisão clínica, podem ser úteis nos pacientes em que os dados clínicos não permitem o diagnóstico diferencial entre a colite ulcerosa e a doença de Crohn. 

Localização dos enzimas num neutrófilo fixado por etanol (adaptado de ckcsphysiology.wikispaces.com)

Se, em vez do etanol, utilizarmos o formol como fixador, não ocorre a desgranulação dos neutrófilos, pelo que as enzimas se mantêm no citoplasma. Deste modo, utilizando como substrato neutrófilos humanos e variando o fixador (etanol / formol) podemos pesquisar a presença de anticorpos pANCA ou cANCA, por imunofluorescência indirecta.

 

Padrão	Auto-anticorpo	Método de fixação
		Etanol	Formol	Metanol
cANCA	anti – PR3	c - ANCA	c - ANCA	c - ANCA
pANCA	anti - MPO	p - ANCA	c - ANCA	-
xANCA		x - ANCA	-	x - ANCA

    Anticorpos anti - citoplasma do neutrófilo (x630) - pANCA

    Anticorpos anti - citoplasma do neutrófilo (x630) - cANCA

    Anticorpos anti - citoplasma do neutrófilo (x630) - xANCA

    Anticorpos anti - citoplasma do neutrófilo (x630) - xANCA

    Anticorpos anti - citoplasma do neutrófilo (x630) - xANCA (aspecto mais granular)

Anticorpos anti - Centríolo



O centrossoma é uma região celular localizada perto do invólucro nuclear, que desempenha um papel relevante na organização do citoesqueleto durante a interfase e dos pólos do fuso mitótico durante a divisão celular, após replicação do centrossoma. É composto por um material amorfo e electrodenso, identificando-se, na sua parte central, um par de estruturas cilíndricas com disposição perpendicular, designadas por centríolos.

Estrututalmente, o centríolo é constituído por um conjunto de nove subunidades de três microtúbulos combinados, permanecendo cada grupo ligado longitudinalmente ao adjacente. Estes nove grupos formam a "parede" da estrutura, como hélices de uma turbina.

Quando presentes, os anticorpos anti - centríolo podem identificar-se por imunofluorescência indirecta (IFI), utilizando como substrato células Hep2. O padrão de fluorescência é característico, com observação de uma ou duas estruturas punctiformes fluorescentes, adjacentes à membrana nuclear (células em interfase) e de uma estrutura punctiforme fluorescente em cada pólo do fuso mitótico (célula em metafase).
Estes autoanticorpos são pouco frequentes e de identificação casual, representando aproximadamente 0,1% do total de autoanticorpos identificados na rotina laboratorial.
Ligam-se a proteínas do centrossoma, incluindo a enolase.
Aparecem associados com:
   - fenómeno de Raynaud secundário;
   - doenças do espectro da esclerodermia, incluindo doentes com fenómeno de Raynaud e telangiectasias, esclerodermia limitada e esclerodermia difusa. Os anticorpos anti - centrossoma e anti - centríolo ocorrem em aproximadamente 0,4 a 5% dos doentes, e podem anteceder o diagnóstico clínico de esclerodermia em vários anos;
   - conectivite indiferenciada;
   - casos de hipertiroidismo que desenvolvem posteriormente fenómeno de Raynaud e telangiectasias;
   - doenças infecciosas (viroses)

    Hep2 (x400) - Anticorpos anti - centríolo. Estrutura punctiforme fluorescente em cada um dos pólos do fuso (célula em metafase) e uma ou duas estruturas punctiformes fluorescentes no citoplasma (células em interfase)

    Hep2 (x400) - Anticorpos anti - centríolo

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - centríolo

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - centríolo

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - centríolo

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - centríolo

    Hep2 (x630) - Anticorpos anti - centríolo

    Hep2 (x1000) - Anticorpos anti - centríolo

    Hep2 (x1000) - Anticorpos anti - centríolo

Anticorpos anti - endomísio

A doença celíaca é uma das doenças crónicas mais comuns, com uma prevalência de 1% na população geral, que poderá ser superior nalguns países desenvolvidos.

Caracteriza-se clinicamente por malabsorção intestinal após a ingestão de glúten e, histologicamente, por atrofia das vilosidades da mucosa do intestino delgado. Estas alterações da mucosa revertem favoravelmente quando se elimina o glúten da dieta.

A ingestão de glúten (fracção proteica do trigo, cevada e centeio) é o principal factor ambiental desencadeante da doença. A concentração elevada de glutamina e prolina no glúten implica uma digestão parcial destes constituintes, sendo os resíduos parcialmente digeridos que, nos indivíduos geneticamente susceptíveis, desencadeiam os processos imunológicos relacionados com a doença.

Existe uma forte associação entre a presença dos haplótipos HLA-DQ2 e HLA-DQ8 e a doença celíaca (97% dos casos). No entanto, é muito importante realçar que cerca de 30-40% da população geral apresenta o haplótipo HLA-DQ2, pelo que a presença destes genes HLA, embora necessária, não é suficiente para o desenvolvimento da doença. Também estão envolvidos genes não - HLA.

Actualmente, decorrem diversos estudos em que se pretende avaliar a importância dos microrganismos intestinais na patogénese da doença.

O processo imunológico na doença celíaca caracteriza-se por uma resposta T-helper glúten - específica, com produção de interferão gama.

A transglutaminase tecidular é fundamental no desencadear deste processo, ao converter a glutamina da gliadina em ácido glutâmico. O consequente aumento da carga negativa vai implicar uma ligação mais forte à molécula HLA-DQ2, na superfície das células de apresentação de antigénios, com resposta celular (linfócitos B e T - glúten específicos), e produção de anticorpos anti - transglutaminase tecidular (muito importantes para o diagnóstico da doença).

As manifestações clínicas, intestinais e extra - intestinais, são muito variáveis. Nos adultos, a doença celíaca é assintomática ou com sintomatologia mínima, levando a um subdiagnóstico. A maioria dos casos de doença celíaca surge durante a infância, com um quadro clínico clássico de diarreia com esteatorreia, vómitos e dor abdominal, após a introdução dos cereais na dieta.

Podem ocorrer situações em que os indivíduos, embora assintomáticos, apresentam serologia e alterações histológicas na biópsia intestinal características da doença. Outros pacientes poderão apresentar sintomatologia e serologia de doença celíaca, sem alterações histológicas do intestino.

Recentemente, a Sociedade Europeia de Gastroenterologia, Hepatologia e Nutrição Pediátrica propôs que a doença celíaca fosse definida como uma "doença sistémica autoimune, desencadeada pelo glúten e prolaminas relacionadas, num indivíduo geneticamente susceptível, e caracterizada por diversas associações de manifestações glúten - dependentes, anticorpos específicos da doença, haplótipos HLA-DQ2 ou HLA-DQ8, e enteropatia".

A serologia da doença celíaca (anticorpos anti - endomísio, anti - transglutaminase e anti - gliadinas deaminadas) é importante no diagnóstico e na monitorização desta patologia. Os anticorpos presentes são, geralmente, da classe IgA, embora também possam ser da classe IgG (particularmente nos indivíduos com déficit de IgA).

Os anticorpos anti - transglutaminase e os anticorpos anti - gliadina deaminada são os marcadores serológicos mais sensíveis e específicos da doença.

 A pesquisa dos anticorpos anti - endomísio é efectuada por imunofluorescência indirecta, utilizando cortes de esófago de primata. Os anticorpos ligam-se ao tecido conjuntivo que rodeia o músculo liso, originando um padrão característico, com fluorescência do músculo liso vascular, da muscularis mucosae e da camada muscular. 

A sua sensibilidade e especificidade são de, aproximadamente 90% e 100%.

O título de anticorpos anti - endomísio, nos doentes submetidos a dieta sem glúten, diminui ao longo do tempo, pelo que uma serologia negativa não deve excluir a doença celíaca.

    Esófago (x100). Estrutura da parede esofágica.

    Anticorpos anti - endomísio (x100). Fluorescência característica na muscular da mucosa e na muscular.

    Anticorpos anti - endomísio (x100)

    Anticorpos anti - endomísio (x100). Camada muscular (1 - circular interna; 2 - longitudinal externa)

    Anticorpos anti - endomísio (x400). Muscular da mucosa. Observa-se a fluorescência do endomísio,
    envolvendo cada fibra muscular. Ausência de fluorescência nas fibras.

    Anticorpos anti - endomísio (x400). Fluorescência do endomísio na camada muscular.